離子交換層析的核心原理是利用待分離物質(zhì)（如抗體、雜蛋白）與離子交換樹(shù)脂之間的靜電相互作用差異，通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖液的 pH 或離子強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)不同物質(zhì)的可逆結(jié)合與洗脫分離。

1. 離子交換樹(shù)脂的結(jié)構(gòu)與類型

離子交換樹(shù)脂是層析的固定相，由惰性載體（如纖維素、瓊脂糖、聚苯乙烯）和共價(jià)結(jié)合在載體上的帶電功能基團(tuán)組成，分為兩類：

陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：載體上連接帶負(fù)電的基團(tuán)（如羧甲基 - COOH、磺酸基 - SO?H），可結(jié)合溶液中帶正電的陽(yáng)離子物質(zhì)（如 pH 低于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)）。

陰離子交換樹(shù)脂：載體上連接帶正電的基團(tuán)（如二乙氨基乙基 - DEAE、季銨基 - Q），可結(jié)合溶液中帶負(fù)電的陰離子物質(zhì)（如 pH 高于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)）。

2. 待分離物質(zhì)的帶電性（以抗體為例）

蛋白質(zhì)的帶電性由其等電點(diǎn)（pI） 和溶液 pH 決定：

當(dāng)溶液 pH ＞ 蛋白質(zhì) pI 時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，可結(jié)合陰離子交換樹(shù)脂（如 DEAE - 纖維素）；

當(dāng)溶液 pH ＜ 蛋白質(zhì) pI 時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電，可結(jié)合陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（如 CM - 纖維素）。

抗體（IgG）的等電點(diǎn)約為 5.8~7.3，因此在常用的中性緩沖液（pH 7.0~7.4）中，IgG 帶負(fù)電，通常選擇陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行純化。

3. 結(jié)合與洗脫的過(guò)程

上樣結(jié)合：將預(yù)處理后的樣品（如鹽析后的抗體溶液，需透析至低離子強(qiáng)度緩沖液）緩慢加入層析柱，此時(shí)帶電荷的抗體與樹(shù)脂上的相反電荷基團(tuán)發(fā)生靜電結(jié)合，而電荷差異大的雜蛋白（如白蛋白）則不結(jié)合或結(jié)合力弱，隨流出液（穿透液）流出。

洗脫分離：通過(guò)逐步提高洗脫液的離子強(qiáng)度（如加入 NaCl 梯度）或改變 pH，破壞抗體與樹(shù)脂的靜電結(jié)合：

離子強(qiáng)度升高時(shí)，溶液中的高濃度反離子（如 Cl?）會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合樹(shù)脂上的帶電基團(tuán)，將抗體置換下來(lái)；

pH 改變時(shí)，抗體的帶電性會(huì)變化（如 pH 降至抗體 pI 以下，抗體帶正電），從而脫離樹(shù)脂。

不同物質(zhì)與樹(shù)脂的結(jié)合力不同，會(huì)在不同離子強(qiáng)度 /pH 條件下被洗脫，形成不同的洗脫峰，收集含目標(biāo)抗體的峰即可完成分離。

4. 核心關(guān)鍵點(diǎn)

離子交換層析的分離效果取決于：

待分離物質(zhì)的等電點(diǎn)與緩沖液 pH 的差值（差值越大，結(jié)合力越強(qiáng)）；

離子交換樹(shù)脂的類型與功能基團(tuán)強(qiáng)度（強(qiáng)離子交換樹(shù)脂如磺酸基、季銨基，結(jié)合力強(qiáng)，適用范圍廣；弱離子交換樹(shù)脂如羧甲基、DEAE，結(jié)合力溫和，選擇性更高）；

洗脫梯度的設(shè)計(jì)（線性梯度洗脫分離效果優(yōu)于階躍洗脫）。