1. PCR

載體構(gòu)建大部分時(shí)候都要通過PCR的方法獲取目的片段，擴(kuò)增PCR的時(shí)候大家盡量選用高保真的PCR酶來進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增之前我們首先要了解目的基因序列信息。其次高質(zhì)量的模板對(duì)PCR成功與否也很重要，以質(zhì)粒作為模板的PCR相對(duì)來說先擴(kuò)增，基因組DNA和cDNA相對(duì)來說較難獲取一些。

引物設(shè)計(jì)工作，一般很多軟件都可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，例如pirmer5之類的軟件。除了常用的酶切連接的方法也可以使用無縫克隆的方法構(gòu)建，選用哪種方法我們都要在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候考慮到，酶切連接的方法和無縫克隆引物設(shè)計(jì)注意點(diǎn)如下：

1） 無縫克隆方法設(shè)計(jì)引物的時(shí)候要加入同源重組臂序列。

2） 做酶切連接引物設(shè)計(jì)要注意加上保護(hù)堿基，保護(hù)堿基大部分加入4個(gè)堿基可以滿足大多數(shù)內(nèi)切酶，也可以參照限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基添加表加保護(hù)堿基。

在擴(kuò)增前我們應(yīng)了解目的片段是否有高GC、或者重復(fù)序列之類的特殊序列，還有片段長度都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)，不推薦一次構(gòu)建片段5K以上的實(shí)驗(yàn)，如果片段過長我們可以通過拆分目的片段來分步構(gòu)建。

一定要注意要設(shè)計(jì)好之前的用到的內(nèi)切酶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，片段長度的增加與實(shí)驗(yàn)難度是成正比的，如果你的目的片段含有高GC序列，可以加入DMSO之類的輔助劑增加PCR的擴(kuò)增效率，現(xiàn)在市面上針對(duì)高GC等特殊結(jié)構(gòu)的PCR酶也很多，大家也可以用此類的酶擴(kuò)增，擴(kuò)增好PCR要進(jìn)行純化回收，此步不多講，一般膠回收試劑盒都能滿足要求。

2. 線性化所用載體

很多人習(xí)慣先構(gòu)建到T載體再進(jìn)行下一步的構(gòu)建，其實(shí)基本直接構(gòu)建到最終載體成功率也非常高，以下一些注意事項(xiàng)希望能幫大家節(jié)省時(shí)間直接省略T載體構(gòu)建一步成功。

線性化載體的時(shí)候，驗(yàn)證過載體是沒有問題的，通常我們單酶切或雙酶切的時(shí)候要注意內(nèi)切酶的buffer是否沒有用錯(cuò)，一般根據(jù)說明書再延長一些時(shí)間會(huì)使線性化更加徹di，增加載體構(gòu)建的陽性率，

3. 連接反應(yīng)

一般載體與目的片段的比例推薦1:1到1:4，使用nanodrop進(jìn)行定量，通常根據(jù)紫外燈通過亮度對(duì)比也是可以的，連接反應(yīng)的時(shí)候在冰上操作，此步要操作輕柔，載體和片段連接酶之類的加入要混勻，PCR上機(jī)反應(yīng)

4. 轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)要保證感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，通常實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)化之后要加入培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，海創(chuàng)科業(yè)小編大量經(jīng)驗(yàn)驗(yàn)證可以不必復(fù)蘇，直接涂板，無論是amp抑菌類的抗生素或者kana殺菌類的抗生素都是可以直接涂板的。涂板之后37℃過夜培養(yǎng)即可。

5. 菌落PCR鑒定

做菌落PCR鑒定的時(shí)候引物一般選擇載體上的通用引物來鑒定，因?yàn)檫x用目的片段兩端的引物可能會(huì)出現(xiàn)假陽性；操作方法一般挑取單克隆在小的EP管培養(yǎng)4小時(shí)左右，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁的情況即可以進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定完成后一般送三四個(gè)送測序驗(yàn)證即可，pcr過程可能會(huì)發(fā)生突變，所以多送幾個(gè)克隆可以保證我們所要的克隆順利獲得。