PCR的基礎(chǔ)原理

一章 PCR和RT-PCR基礎(chǔ)

PCR基礎(chǔ)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）過程利用模板變性，引物退火和引物延長的多個(gè)循環(huán)來擴(kuò)增DNA序列。這是一個(gè)指數(shù)增長的過程，因?yàn)樯弦惠喌臄U(kuò)增產(chǎn)物又作為下一輪擴(kuò)增的模板，使其成為檢測核酸的一種非常靈敏的技術(shù)。一般，經(jīng)過20-30個(gè)循環(huán)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物就足夠在溴化乙錠染色的凝膠上觀察到。反應(yīng)包括幾個(gè)成分（表1）。模板可以為純化的基因組或質(zhì)粒DNA；由RNA轉(zhuǎn)化得到的cDNA；或未經(jīng)純化的粗制生物樣品，如細(xì)菌克隆或噬菌斑。引物確定了擴(kuò)增產(chǎn)物的序列和長度。常用的熱穩(wěn)定聚合酶是Taq DNA聚合酶。這種酶適用于常規(guī)擴(kuò)增，但是使用其他熱穩(wěn)定聚合酶會改善結(jié)果。擴(kuò)增反應(yīng)還包括緩沖液，三磷酸脫氧核苷及鎂離子。鎂離子濃度影響酶的活性、引物退火、模板和PCR產(chǎn)物的熔點(diǎn)（Tm），忠實(shí)性以及引物二聚體的形成等。在隨后的章節(jié)中將討論這些成分、循環(huán)參數(shù)以及其他參與作用的因子相互間各種作用對于成功PCR的影響。

表1. 反應(yīng)成分

Component Final Concentration

Template 10^4-10^6 copies of DNA template

Primer 1 0.1-0.5µM

Primer 2 0.1-0.5µM

10X Reaction buffer 1X

Magnesium 1.0-3.0mM

dNTP mix 200 mM each dNTP

Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction

RT-PCR基礎(chǔ)

RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達(dá)信息進(jìn)行檢測或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。

PCR的基礎(chǔ)原理

圖1. RT-PCR概圖

這本指南闡述了成功RT-PCR和PCR的關(guān)鍵。高靈敏性（從小量樣品中得到足量結(jié)果）和高特異性（選擇性地僅得到所需的產(chǎn)物）是成功PCR的標(biāo)志?？梢酝ㄟ^仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（如選擇恰當(dāng)?shù)拿福O(shè)計(jì)理想的引物，使用不同的緩沖液和添加劑，確定循環(huán)參數(shù)及制備高質(zhì)量的模板等）以獲得的RT-PCR和PCR。

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